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免疫组化试剂_免疫组化试剂实验操作步骤

免疫组化试剂盒用于体外诊断。Histostain®-Plus试剂盒用于检测与人体组织或细胞标本。

免疫组化试剂盒用于体外诊断。Histostain®-Plus试剂盒用于检测与人体组织或细胞标本。

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免疫组化试剂盒适用范围为冰冻切片和石蜡包埋组织切片,新准备好的淋巴细胞,和固定的培养细胞。 

实验步骤:

一、脱蜡水化

1、石蜡切片置于新鲜的二甲苯中,浸泡15 min × 2次;

2、去除多余的液体后,置无水乙醇中,浸泡3 min × 2次;

3、去除多余的液体后,置95%乙醇中,浸泡3 min;

4、 去除多余的液体后,置85%乙醇中,浸泡3 min;

5、自来水冲洗1 min;

6、PBS溶液冲洗3 min × 3次。

二、加热EDTA抗原修复液(试剂1,采用微波进行抗原修复)

1、将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯(或修复盒)中的耐高温塑料切片架上;

2、加适量的修复液1x EDTA抗原修复液,(溶液1,用纯净水稀释20倍后)于烧杯中,液面要浸过切片组织一定高度;

3、微波炉先用高档加热使液体沸腾,当加热至沸腾时调到中档,此时开始计时,修复时间一般为20 min,此过程中勿使组织干片(修复液要足量);

4、将烧杯从微波炉中拿出,放入冷水中冷却降温;

5、当修复液降至室温后取出玻片,用PBS(PH7.4)冲洗3 min × 3次。

注意:抗原修复时,修复液务必保证切片始终浸泡在液体内,一般情况:修复液的量为800 mL/1架-1500 mL/3架;取出玻片,用PBS冲洗时,切勿对着组织冲洗,以免弄破组织。

三、阻断内源性过氧化物酶

1、用吸水纸擦干玻片,免疫组画笔在组织周围画圈;

2、将3%的过氧化氢(试剂2),滴加100 μL到切片组织上以阻断内源性过氧化物酶,室温孵育15 min;

3、PBS冲洗3 min × 3次。

四、封闭

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用吸水纸擦干玻片,滴加正常山羊血清(试剂3),室温封闭15 min,以减少非特异性染色。

五、一抗孵育

1、用吸水纸擦干玻片组织周围的液体;

2、滴加单克隆抗体(试剂4)100 μL,如果做阴性对照实验,就在对照组的组织上滴加PBS作为阴性对照,置于湿盒中室温孵育1h或4°C孵育过夜。

六、复温

1、样本4℃过夜从冰箱拿出后需在室温下孵育15 min复温(抗体孵育为4℃过夜选用此步骤,如室温孵育直接进入下一步清洗);

2、PBS冲洗3 min × 3次。

七、加聚合物辅助剂(试剂5)

1、吸水纸擦干切片后滴加试剂5(Polymer Helper),室温或37℃孵育20 min;

2、PBS冲洗3 min ×3次。

八、 二抗孵育

1、吸水纸擦干切片后滴加试剂6(Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG),室温或37℃孵育20 min;

2、PBS冲洗3 min × 4次。

九、显色

1、甩去PBS液,吸水纸擦干切片;

2、每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液100 μL(试剂7:试剂8=1:49比例配置),孵育3-5 min,光学显微镜下观察染色结果,切勿显色过深;

3、显色后用自来水冲洗切片终止显色。

十、复染

加100 μL的苏木素(试剂9)复染,孵育30 s-1 min左右,自来水冲洗5 min。

注意:依据作用的苏木素染色液强度和孵育时间长短,对比染色结果导致细胞核呈现淡蓝到深蓝颜色的反应,而过染或者不足都可能影响正确结果的判断。

十一、 脱水、透明、封片

1、将切片放入70%酒精,浸泡2 min;

2、将切片放入80%酒精,浸泡2 min;

3、将切片放入90%酒精,浸泡2 min;

4、将切片放入95%酒精,浸泡2 min;

5、将切片放入无水乙醇,浸泡2 min × 2次;

6、将切片放入二甲苯,浸泡2min × 2次;

7、通风橱中风干切片;

8、滴加中性树胶,盖玻片封片。

以上就是关于免疫组化试剂实验操作步骤的介绍,更多资讯请关注本站WAM机械网!